A obtenção de um diagnóstico molecular preciso e oportuno depende, em grande parte, do progresso na descoberta dos genes e mecanismos genéticos associados as doenças genéticas raras (DGRs). Embora o número exato de DGRs seja debatido, estima-se que milhares de genes e mecanismos da doença permanecem desconhecidos. Nos últimos 8 anos, o sequenciamento do genoma, tanto em pesquisas quanto em ambientes clínicos, tem sido uma ferramenta poderosa para descobrir novos genes de DGRs que eram intratáveis ​​em abordagens anteriores. A maioria dos avanços tem sido em apresentações clínicas altamente reconhecíveis associadas à idade precoce de início e morbidade e mortalidade significativas e causadas por variantes altamente penetrantes (geralmente codificadoras de proteínas). A utilidade diagnóstica do sequenciamento tem se traduzido na  pratica clínica, com um rendimento diagnóstico na faixa de 25% a 30% entre coortes grandes e heterogêneas de DGRs (https://doi.org/10.1038/s41525-018-0053-8). Antes da introdução do sequenciamento de próxima geração (NGS – Next-generation Sequencing), várias tecnologias foram utilizadas para identificar a base das doenças genéticas. A mais antiga, a análise do cariótipo com banda G, pode detectar  aberrações cromossômicas numéricas, bem como mosaicismo. No entanto, o rendimento diagnóstico é limitado porque anormalidades abaixo de 5–10 megabases muitas vezes  passam despercebidas. No início da década de 1990, foi desenvolvida a hibridização fluorescente in situ (FISH). FISH detecta anormalidades genéticas abaixo do limiar do cariótipo por banda G, facilitando a detecção de eventos submicroscópicos (por exemplo, deleções adjacentes aos telômeros) envolvidos na doença. FISH, no entanto, é restrito à avaliação de regiões cromossômicas que podem ser direcionadas por sondas fluorescentes, além disso, anormalidades abaixo de 50-300 kb não podem ser detectadas (https://doi.org/10.1073/pnas.1213818110). Analise Cromossômica por Microarray (CMA) que permite a avaliação simultânea de todos os cromossomos para desequilíbrios de número de cópias e, em alguns casos, isodissomia uniparental (https://doi.org/10.1038/gim.2012.35). O CMA é frequentemente oferecido como um teste de partida na avaliação de crianças que apresentam doenças nas quais se acredita ter uma base genética, tais como múltiplas anormalidades congênitas e atraso no desenvolvimento, com uma taxa de detecção entre 15% e 20%, dependendo da indicação clínica (https://doi.org/10.1155/2016/6421039).

O NGS permite o sequenciamento de grandes quantidades de DNA, avançando significativamente no estudo da genética e substituindo métodos mais antigos, como o sequenciamento de Sanger. Essa tecnologia está se tornando mais comum na área de saúde e pesquisa, não apenas porque é um método confiável de determinar variações genéticas, mas também porque é econômica e permite que os pesquisadores sequenciem genomas inteiros em qualquer lugar e em pouco tempo. O NGS inclui tanto o sequenciamento completo do exoma (WES – Whole Exome Sequencing) quanto o sequenciamento do genoma completo (WGS – Whole Genome Sequencing). Todos os fragmentos de DNA de um indivíduo que fornecem instruções para a produção de proteínas, chamados de exons, representem 1,5% do genoma de uma pessoa. Juntos, todos os exons em um genoma são conhecidos como exoma, e o método de sequenciamento deles é conhecido como sequenciamento do exoma completo (WES). Este método permite que variações na região codificadora de proteína de qualquer gene sejam identificadas, ao invés de apenas em alguns genes selecionados. Como a maioria das variantes conhecidas que causam doenças ocorrem em exons, acredita-se que o sequenciamento completo do exoma seja um método eficiente para identificar possíveis mutações causadoras de doenças. No entanto, variações do DNA fora dos exons podem afetar a atividade do gene e a produção de proteínas e levar a distúrbios genéticos – variações que o sequenciamento completo do exoma deixaria escapar. Outro método, denominado sequenciamento do genoma completo, determina a ordem de todos os nucleotídeos no DNA de um indivíduo e pode determinar variações em qualquer parte do genoma (WGS) (https://doi.org/10.1073/pnas.1418631112).

Na população pediátrica e neonatal com doença rara, não diagnosticada ou genética, reduzir o tempo até o diagnóstico é importante porque a progressão da doença pode ser rápida. Existem aproximadamente 4.000 genes com uma variante causadora de fenótipo e muitos deles expressando-se nos primeiros 28 dias de vida. Nas admissões em unidades de terapia intensiva neonatal, o teste genético em série pode ser muito lento para se alcançar o manejo clínico ideal. Somado a isso, o fenótipo clínico completo pode não se manifestar em neonatos devido ao estágio inicial de suspeita da doença. Além disso, um grande grau de heterogeneidade clínica e genética é frequentemente observado em neonatos com doenças agudas, o que contribui ainda mais para a falta de um diagnóstico molecular oportuno para suspeitas de doenças genéticas (https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2019-106111). Desenvolvimentos tecnológicos recentes em NGS de forma rápida destacaram seu uso em crianças, particularmente em neonatos gravemente enfermos. Saunders et al (2021) relataram redução no intervalos de tempo do diagnóstico de 5 a 8 dias para até 19,5 horas (https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3004041). O sequenciamento rápido do genoma como um teste de primeira linha em unidades de terapia intensiva neonatal e pediátrica tem sido associado a um alto rendimento diagnóstico e redução do custo potencial com a saúde (https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aat6177)

Quando o sequenciamento de DNA é inconclusivo, uma abordagem multiômica pode fornecer uma compreensão abrangente dos processos moleculares. Isso inclui a integração da epigenômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica. A epigenômica explora modificações de DNA em todo o genoma, a transcriptômica analisa a expressão de RNA em todos os RNAs, a proteômica revela estruturas, funções, interações e níveis de proteínas em larga escala, e a metabolômica examina a identificação e a quantificação de metabólitos em espécimes biológicos. Apesar desses avanços tecnológicos, o diagnóstico de doenças raras apresenta diversos desafios. Muitos profissionais têm dificuldade em interpretar essas novas descobertas, o que gera uma demanda por especialistas que possam traduzir os resultados em insights clínicos. Os testes frequentemente não estão disponíveis em ambientes médicos com poucos recursos, exigindo encaminhamentos para centros especializados, o que pode levar a um aumento de tempo e custos. Métodos diagnósticos avançados, incluindo WES/WGS, metilação de DNA, sequenciamento de RNA, proteômica e metabolômica, exigem tecnologias sofisticadas, repositórios de dados, bioinformática complicando ainda mais a acessibilidade (https://doi.org/10.1038/s41390-024-03728-w).

Quando os resultados do sequenciamento de DNA não são conclusivos, uma estratégia envolvendo múltiplas ômicas pode oferecer uma visão mais completa dos processos moleculares. Isso envolve a combinação da epigenômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica. A epigenômica investiga as modificações do DNA em todo o genoma, a transcriptômica examina a expressão de RNA em todas as suas formas, a proteômica revela as estruturas, funções, interações e quantidades de proteínas em larga escala, e a metabolômica se dedica à identificação e medição de metabólitos em amostras biológicas. Apesar dos avanços tecnológicos, o diagnóstico de doenças raras enfrenta muitos obstáculos. Muitas vezes, os profissionais têm dificuldade em interpretar essas novas informações, criando uma necessidade de especialistas capazes de converter os resultados em conclusões clínicas. Os testes frequentemente não estão disponíveis em estabelecimentos de saude com recursos limitados, o que leva a encaminhamentos para centros especializados, resultando em aumento de tempo e custos (https://doi.org/10.1038/s41390-024-03728-w).

Nas últimas décadas, testes genéticos identificaram variantes causais em muitos pacientes com doenças raras, mas uma proporção significativa permanece sem diagnóstico. É necessário o contínuo financiamento de programas de pesquisa dedicados ao diagnóstico de doenças raras e não diagnosticadas. Embora os avanços obtidos possam levar a uma redução no custo de tecnologias avançadas, o sequenciamento direcionado, algoritmos computacionais de última geração, plataformas de compartilhamento de dados e abordagens de aprendizado de máquina serão cruciais para superar os desafios relacionados à detecção e interpretação de variantes.